Eurospital - Divisione Diagnostici

EuSepScreen

Dispositivo medico diagnostico in vitro

Campo di applicazione
Il Kit EuSepScreen Eurospital viene usato per determinare la presenza o meno in campioni biologici quali sangue, liquor, liquido pleurico, liquido sinoviale o qualunque altro liquido o materiale biologico umano normalmente sterile, di DNA batterico appartenente a tutti i sierogruppi di Neisseria meningitidis (A,B,C,X,Y,W135,H,Z,29 E,NT), tutti i 90 sierotipi di Streptococcus pneumoniae, i sierotipi b, c di Haemophilus influenzae e tutti i sierotipi di Adenovirus (a-f).

Principio del metodo
Meningite e sepsi sono patologie estremamente gravi; sono causa di mortalità elevata (1,2) e richiedono una determinazione rapida e precisa sia per impostare un corretta terapia che una precoce profilassi nei casi in cui questa è richiesta (infezioni da Neisseria meningitidis o Haemophilus influenzae tipo b) (3).
La rapidità dell’accertamento di questi agenti patogeni permette inoltre di effettuare un efficace controllo sull’impatto mass-mediatico, evitando le situazioni di panico associate a meningite e patologie similari.
I germi teoricamente capaci di indurre meningite o sepsi sono innumerevoli, ma nella pratica medica è ben noto che un piccolo gruppo di essi è capace di determinare oltre il 90% delle meningiti (4). Nel bambino e adulto sano infatti meningococco e pneumococco da soli rappresentano oltre il 70% delle forme di meningite/sepsi (4). Un’eccezione può essere rappresentata dal paziente immunodepresso nel quale oltre a tutti i germi sopra elencati, possono essere trovati anche altri patogeni.
I metodi colturali fino ad oggi considerati il gold-standard per la diagnosi presentano alcuni punti di debolezza: innanzitutto necessitano della presenza di germi vivi e ben vitali e di conseguenza possono risultare falsamente negativi in soggetti nei quali il trattamento antibiotico è stato iniziato prima della coltura (5) sono poi fortemente dipendenti dal volume di campione prelevato (6), così come dalla rapidità del trasporto dei campioni e dell’esecuzione del test dopo il prelievo. Un problema non meno grave è che tali metodi possono richiedere molti giorni prima che un campione venga refertato come negativo oppure, nei casi di lenta crescita (5), possono essere necessari molti giorni prima di concludere che probabilmente si tratta di un risultato falsamente positivo per contaminazione.

I metodi che si basano sulla biologia molecolare non necessitano di germi vivi, pertanto non presentano le limitazioni di sensibilità tipiche dei metodi colturali (7,8). Per questo motivo tali metodi possono risultare estremamente efficaci in pazienti che abbiano già ricevuto terapia antibiotica, non risentono inoltre della rapidità del trasporto (tanto che i campioni possono essere conservati a temperatura ambiente anche alcuni giorni) ed infine non richiedono alcun terreno di cultura.

Il kit EuSepScreen è stato disegnato per ottenere la più alta sensibilità e specificità nella determinazione della maggior parte delle malattie batteriche invasive (meningiti, sepsi, polmoniti, ecc.) sia del bambino che dell’adulto utilizzando direttamente campioni biologici quali sangue, liquor, liquido pleurico, liquido sinoviale o qualunque altro liquido o materiale biologico umano normalmente sterile.

Nel kit EuSepScreen, indicato per pazienti quali bambini e adulti, la scelta dei batteri inclusi è stata formulata a partire dall’attuale quadro epidemiologico italiano, in modo che venissero inclusi i germi causa di circa il 90% delle meningiti/sepsi che si verificano in pazienti di queste età (4).
Il sistema di rilevamento è capace di individuare inequivocabilmente il germe verso il quale è diretto e tale da non provocare alcuna cross-reazione con altri germi o con DNA umano (7,9).
L’inserimento dell’Adenovirus risponde ad una specifica necessità clinica di diagnostica differenziale: è ben noto infatti che l’Adenovirus è in grado, sia da un punto di vista clinico che da un punto di vista laboratoristico, di mimare una situazione settica (10), con febbre persistente elevata, marcata leucocitosi neutrofila, ed elevati indici di flogosi.

I risultati ottenuti con questo metodo hanno permesso di dimostrare una specificità del 100% (nessun risultato falso positivo) sia quando utilizzati a partire da liquor che quando utilizzati a partire da sangue intero o altri liquidi biologici umani (7, 8).
La sensibilità del metodo nei confronti del metodo colturale è apparsa doppia (sensibilità del 200%) nel caso delle meningiti e, per quanto riguarda lo pneumococco, circa 10 volte più elevata (sensibilità del 1000%) nelle polmoniti (8).

Materiali forniti
(quantità sufficiente per 8 test)

Composizione dei materiali/reagenti forniti

Acqua per ricostituzione controllo 1x0,5 ml
Reagente A 1x1,5 ml
Controllo positivo (liofilo) 1x0,4 ml
Mix 1 (provetta rossa) 1strip x 8 prov.
Mix 2 (provetta verde) 1 strip x 8 prov.
Mix 3 (provetta trasparente) 1 strip x 8 prov.

1. Acqua per ricostituzione controllo
1 fiala tipo Eppendorf contenente 0,5 ml di acqua per PCR da utilizzare per la ricostituzione del controllo positivo.
2. Reagente A
1 fiala da 1,5 ml, tappo verde, contenente diluente per master mix. Pronto all’uso.
3. Controllo positivo
1 fiala, tappo rosso, contenente del DNA reattivo per tutte le Mix. Liofilo, da risospendere al primo utilizzo.
4. Mix 1
1 strip da 8 provette rosse sigillate da un foglio di alluminio. Ogni provetta contiene, in forma essiccata, il sistema di rilevamento per Neisseria meningitidis e Streptococcus pneumoniae..Attenzione: evitare l’esposizione diretta alla luce.
5. Mix 2
1 strip da 8 provette verdi sigillate da un foglio di alluminio. Ogni provetta contiene, in forma essiccata, il sistema di rilevamento per Adenovirus e Haemophilus influenzae. Attenzione: evitare l’esposizione diretta alla luce.
6. Mix 3
1 strip da 8 provette trasparenti sigillate da un foglio di alluminio. Ogni provetta contiene, in forma essiccata, il sistema di rilevamento per DNA genomico umano. Attenzione: evitare l’esposizione diretta alla luce.

Strumenti e materiali richiesti ma non forniti
1. Pipette da 5, 20, 100, 200, 500 µl
2. Puntali sterili monouso con filtro, per pipette da 5, 20, 100, 200, 500 µl.
3. Vortex.
5. Microcentrifuga per provette
6. Centrifuga con rotore per micropiastre.
7. Amplificatore con filtri di lettura a 520 e 550 nm.
8. Provette da 0,2 ml con tappi di grado ottico.
9. Micropiastre di grado ottico.
10. Supporto per provette da 0,2 ml
11. Universal PCR Master Mix

Criteri di prestazione
I metodo consente l’identificazione di DNA batterico (Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae e Haemophilus influenzae) o virale (Adenovirus) in un campione biologico dopo processo di estrazione degli acidi nucleici.

Raccolta campioni
Il kit EuSepScreen richiede l’utilizzo di campioni biologici quali sangue, liquor, liquido pleurico, liquido sinoviale o qualunque altro liquido o materiale biologico umano normalmente sterile.

Preparazione dei campioni
Il campione è costituito da DNA estratto da campioni biologici quali sangue, liquor, liquido pleurico, liquido sinoviale o qualunque altro liquido o materiale biologico umano normalmente sterile. Il DNA può essere estratto usando le più comuni metodiche di estrazione del DNA, ma per la massima resa si consiglia l’utilizzo del kit Eu-Gen Estrazione (cod. 9132)

Sensibilità e specificità
40 campioni di DNA estratti da campioni biologici, già caratterizzati presso un centro di riferimento, sono stati testati con questo metodo. I risultati ottenuti con EuSepScreen hanno evidenziato una sensibilità e specificità del 100%.

Conservazione
Tutti i componenti del kit devono essere conservati a 2 – 8°C.

Stabilità dopo la prima apertura
Tutti i componenti, se utilizzati con le accortezze riportate nel capitolo Avvertenze generali, sono stabili fino alla data riportata in etichetta.

Stabilità al trasporto
In uno studio di stabilità accelerata tutti i componenti del dispositivo si sono dimostrati stabili dopo conservazione a 37°C per 96 ore.

Conservazione dei campioni
Il DNA purificato, se non immediatamente sottoposto ad amplificazione, può essere conservato a 2-8°C per 3 mesi, oppure a -20°C per tempi più lunghi: in questo caso è consigliabile suddividerlo in aliquote in modo da evitare congelamenti e scongelamenti ripetuti che potrebbero degradarlo. Il riutilizzo del DNA conservato a -20°C è stato verificato da Eurospital unicamente con i reagenti presenti nel kit Eu-Gen Estrazione (cod. 9132). L’impiego di altri kit di estrazione prevede infatti, la verifica delle relative procedure d’uso da parte del laboratorio, riguardo a stabilità e conservabilità del DNA estratto.

Risospensione del Controllo positivo
Al primo utilizzo, centrifugare brevemente la fiala del Controllo positivo. Utilizzando solo puntali sterili, aggiungere 0,4 ml di acqua per la ricostituzione del controllo. Agitare utilizzando un agitatore meccanico (vortex) per almeno 15 secondi per permettere una corretta risospensione del materiale contenuto all’interno della provetta del controllo. Centrifugare brevemente la fiala per eliminare le gocce dalle pareti e dall’interno del coperchio. Il controllo positivo così risospeso è pronto per l’uso. La stabilità rimane quella indicata in etichetta.

Procedimento di Amplificazione del DNA

1. Da ognuna delle tre mix contenute nel kit, separare con un paio di forbici una provetta per ogni paziente da analizzare dalle strip da 8 provette. Porre le provette in posizione verticale su apposito supporto non fornito;
2. forando con il puntale il foglio di alluminio che sigilla la provetta, aggiungere ad ogni Mix 37,5 µl di Reagente A; pipettare un paio di volte per risospendere il pellet adeso sul fondo;
3. aggiungere ad ogni mix 62,5 µl di Universal PCR Master Mix (reagente richiesto ma non fornito); pipettare un paio di volte per rendere omogenea la soluzione;
4. utilizzando provette o micropiastre dedicate al proprio termociclatore, preparare per ogni campione 4 provette per ogni Mix (12 provette in totale);
5. dispensare 20 µl di ogni Mix in ognuna delle quattro provette, secondo lo schema riportato ad esempio:

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
A	Mix 1 20 µl	Mix 1 20 µl	Mix 1 20 µl	Mix 1 20 µl
B	Mix 2 20 µl	Mix 2 20 µl	Mix 2 20 µl	Mix 2 20 µl
C	Mix 3 20 µl	Mix 3 20µl	Mix 3 20 µl	Mix 3 20 µl

6. per ogni Mix eseguire le seguenti azioni, secondo la tabella sottostante:
non aggiungere niente nella provetta n.1 (controllo negativo di reazione, Bianco, non template control o NTC);
aggiungere 5 µl di campione estratto nelle provette n. 2 e 3 e pipettare un paio di volte per mescolare la soluzione (S1);
aggiungere 5 µl di Controllo positivo nella provetta n. 4 e pipettare un paio di volte per mescolare la soluzione (Controllo positivo, C+);

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
A	Mix 1 NTC	Mix 1 S1	Mix 1 S1	Mix 1 C+
B	Mix 2 NTC	Mix 2 S1	Mix 2 S1	Mix 2 C+
C	Mix 3 NTC	Mix 3 S1	Mix 3 S1	Mix 3 C+

7. chiudere le provette con fogli adesivi o tappi di grado ottico;
8. centrifugare brevemente le provette o le micropiastre per togliere eventuali bolle dalla miscela di amplificazione;
9. impostare i filtri per il rilevamento del segnale: 520 e 550 nm;
10. impostare il volume di reazione a 25 µl;
11. sottoporre le provette ad amplificazione utilizzando il seguente protocollo e settare la lettura ottica dello strumento allo step 4;

Step	Temperature	Tempo	Cicli
1	50 °C	2 min	1
2	95 °C	10 min	1
3	95 °C	15 sec
4	60 °C	1 min

12. analizzare i segnali ottenuti in ogni provetta.

Validazione dei risultati ottenuti.

1. Verificare che i segnali, letti con il filtro a 520 nm, ottenuti con la Mix 3 in entrambe le provette contenenti il campione da testare (S1) siano positivi;
2. verificare che per ogni mix i segnali ottenuti per il controllo NTC siano negativi per entrambi i filtri di lettura (520 e 550 nm);
3. verificare che per ogni mix i segnali ottenuti con il Controllo positivo (C+) siano positivi per entrambi i filtri di lettura (520 e 550 nm);
4. verificare che per le Mix 1 e 2 i segnali ottenuti nelle due provette contenenti il campione da testare (S1) siano concordi: entrambi positivi o entrambi negativi per ogni filtro di lettura utilizzato (520 e 550 nm).

Nel caso non si verifichi almeno una della condizioni sopra riportate, il test deve essere ripetuto.

Interpretazione dei risultati.
La positività ottenuta nella Mix 3 con il campione è indice di una corretta esecuzione della procedura di estrazione degli acidi nucleici.
Per le Mix 1 e 2, la presenza di un segnale per un determinato filtro utilizzato (520 e 550 nm) è indice della presenza in quel campione di materiale genetico appartenente all’agente patogeno secondo il seguente schema:

Mix 1:
positività filtro 520 nm = presenza di Neisseria meningitidis;
positività filtro 550 nm = presenza di Streptococcus pneumoniae
Mix 2:
positività filtro 520 nm = presenza di Adenovirus;
positività filtro 550 nm = presenza di Haemophilus influenzae.

Precauzioni
1. Attendere sempre che i reagenti raggiungano la temperatura ambiente prima di iniziare il test.
2. Attenersi scrupolosamente ai consigli di procedura. In caso di incidente o malessere, chiamare immediatamente un
medico e mostrargli il contenitore, l’etichetta e, se possibile, la scheda di sicurezza.
3. Attenzione: è molto importante non scambiare i componenti di lotti diversi.
4. Nel caso non si operasse sotto cappa, usare sempre la mascherina per evitare la contaminazione delle provette.
5. È consigliabile operare in ambienti distinti e ben delimitati per le fasi di preparazione del campione (estrazione), di preparazione dei reagenti e di amplificazione.
6. Le mix 1, 2 e 3 contengono sequenze specifiche di DNA, sostanze la cui pericolosità non è completamente testata.

Limiti del test
1. Il kit EuSepScreen è stato ottimizzato utilizzando i reagenti di estrazione presenti nel kit Eu-Gen Estrazione (cod. 9132). L’impiego di altri kit di estrazione prevede la verifica delle relative procedure d’uso da parte del laboratorio, riguardo a stabilità e conservabilità del DNA estratto.
2. Si consiglia di utilizzare il DNA immediatamente dopo l’estrazione da sangue. Il DNA purificato, se non immediatamente sottoposto ad amplificazione, può essere conservato a 2-8°C per 3 mesi, oppure a -20°C per tempi più lunghi: in questo caso è consigliabile suddividerlo in aliquote in modo da evitare congelamenti e scongelamenti ripetuti che potrebbero degradarlo. Non sono disponibili dati sulle prestazioni di EuSepScreen con campioni di DNA conservato per periodi più lunghi ed estratto con sistemi diversi da quello precedentemente indicato

Avvertenze generali
Utilizzare sempre puntali sterili con filtro.
Adottare tutte le precauzioni per evitare la contaminazione dei reagenti.
Evitare di lasciare esposte alla luce le mix contenute nei sacchetti minigrip di alluminio.
Una volta prelevato il numero di provette richiesto, riporre immediatamente il resto della strip all’interno del sacchetto minigrip di alluminio. Accertarsi della presenza al suo interno del dessicante.
Evitare di toccare i puntali con le mani.
Indossare sempre dei guanti di protezione per evitare la contaminazione dei reagenti.
Utilizzare solo provette, tappi o fogli adesivi di grado ottico.
Evitare di mescolare tra loro componenti di lotti diversi.
Il kit EuSepScreen non deve essere utilizzato per fini diversi da quelli riportati nel “Campo di applicazione” e ribaditi nei “Criteri di prestazione”.

Troubleshooting
Assenza di segnale.
1. Errata impostazione dei filtri di lettura.
2. Errori di dispensazione od omissione di reagenti.
3. Effetti inibitori del campione: processi di estrazione e purificazione del DNA insufficienti.
4. Errata conservazione del kit.
5. Controllare le performance dell’ amplificatore.

Intensità di segnale troppo bassa.
1. Deterioramento del sistema di rilevamento dovuto ad errato trattamento e/o conservazione dei reagenti.
2. Concentrazioni molto basse di DNA nel campione da analizzare.
3. Inappropriata risospensione delle mix.
4. Bolle d’aria intrappolate all’interno delle provette da amplificazione.

Bibliografia
1. Russell JA. Management of sepsis. N Engl J Med 2006;355:1699-713.
2. Overturf GD. Defining bacterial meningitis and other infections of the central nervous system. Pediatr Crit Care Med. 2005;6(3 Suppl):S14-8.
3. Red book: Edizione Italiana 2006. Pacini Editore Medicina Pisa 2006
4. Italian National Institute of Health. http://www.simi.iss.it/dati.htm Page updated September 27, 2007. Accessed October 20, 2007.
5. Le Monnier A, Carbonnelle E, Zahar JR et al. Microbiological diagnosis of empyema in children: comparative evaluations by culture, polymerase chain reaction, and pneumococcal antigen detection in pleural fluids. Clin Infect Dis 2006; 42 : 1135-1140.
6. Isaacman D J, Karasic RB, Reynolds EA, and Kost SI. Effect of number of blood cultures and volume of blood on detection of bacteremia in children. J Pediatr 1996; 128:190-195.
7. Corless CE, Guiver M, Borrow R, Edwards-Jones V, Fox AJ, Kaczmarski EB. Simultaneous detection of Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae, and Streptococcus pneumoniae in suspected cases of meningitis and septicemia using real-time PCR. J Clin Microbiol. 2001;39:1553-8.
8. Azzari C, Moriondo M, Indolfi G et al. Molecular detection and serotyping on clinical samples improve diagnostic sensitivity and reveal increased incidence of invasive disease by Streptococcus pneumoniae in Italian children. J Med Microbiol 2008, 57: 1205-12.
9. Carvalho Mda G., Tondella M.L., McCaustland K., Weidlich L., McGee L., Mayer L.W., Steigerwalt A., Whaley M., Facklam R.R., Fields B., Carlone G., Ades E.W., Dagan R., Sampson J.S. Evaluation and improvement of real-timePCR assays targeting lyt, ply, and psaA genes for detection of pneumococcal DNA. J Clin Microbiol 2007; 45, 2460-6.
10. Levy Y, Nitzan M, Beharab A, Zeharia A, Schoenfeld T, Nutman J, Rannon L, Steinherz R. Adenovirus type 3 infection with systemic manifestation in apparently normal children. Isr J Med Sci. 1986 Nov;22(11):774-8.
11. Stoll BJ, Hansen N, Fanaroff AA, Wright LL, Carlo WA, Ehrenkranz RA, Lemons JA, Donovan EF, Stark AR, Tyson JE, Oh W, Bauer CR, Korones SB, Shankaran S, Laptook AR, Stevenson DK, Papile LA, Poole WK.et al. Late-onset sepsis in very low birth weight neonates: the experience of the NICHD Neonatal Research Network. Pediatrics 2002; 110: 285-291

EuSepScreen codice 9145 (8 test)

Fabbricante
Eurospital SpA
Via Flavia 122, Trieste – Italia

EuSepScreen– codice 9145 RM 270/2008 1/5